Estrategias para la detección de compuestos organofosforados en fase gas y líquida mediante espectroscopía Raman-SERS

En esta tesis doctoral se han desarrollado plataformas sensibles basadas en la tecnología SERS (Espectroscopía Raman Intensificada por Superficies) para la detección e identificación inequívoca de compuestos organofosforados en fase gas y líquida, agentes de guerra química y pesticidas, respectivamente. En el desarrollo de este trabajo se han estudiado y caracterizado diferentes nanopartículas plasmónicas y su depósito sobre un soporte sólido, nano- y microestructuras con propiedades plasmónicas, así como diferentes estrategias de anclaje del analito a la superficie metálica. Se han caracterizado las capacidades de detección de las plataformas sensibles considerando el metilfosfonato de dimetilo, DMMP, como molécula diana al ser un simulante del gas Sarín y de toda la serie G de agentes neurotóxicos y el paraoxon-metil por ser el metabolito activo del potente pesticida paratión. Además, alguno de los sistemas ha sido caracterizada con 2-cloroetilsulfuro, CEES, simulante del gas vesicante mostaza. Estas plataformas sensibles se han evaluado en términos de sensibilidad, tiempo de repuesta, estabilidad y posibilidad de detección en condiciones de campo. <br /

Evaluación de nanoestructuras para sensores inmunológicos

Esta tesis posee información confidencial, factible de patentamiento, por lotanto no será publicada hasta tanto se realice la protección de propiedad intelectual correspondiente.En este trabajo se estudiaron diferentes nanoestructuras para diferentes aplicaciones de biosensado. Se estudiaron también diferentes formas de funcionalización de los electrodos. Si bien en un principio la aplicación principal de estudio fueron los biosensores inmunológicos, las aplicaciones que se exploraronfueron mucho más amplias, logrando desarrollos muy interesantes y prometedores. Particularmente, el desarrollo de un biosensor para la detección de unaenfermedad muy grave en plantas cítricas, el HLB, permitió lograr un dispositivo que se encuentra en fase de patentamiento y prueba de factibilidad encampo.El primer material estudiado fue el ZnO, en diferentes formas nanoestructuradas, particularmente nanopartículas (NPs), nanohilos (NWs) y thin films(TFs). Para esto se desarrolló un biosensor de glucosa, el cual permite la cuantificación de concentraciones muy bajas de glucosa. El mismo presentó mejorsensibilidad que los biosensores de glucosa de primera generación, debido alempleo de nanoestructuras de óxido de zinc (NPs y NWs) en la superficie delbiosensor de pasta de carbón, a diferencia de la inmovilización en volumen comúnmente empleada en este tipo de sensores. Con esta metodología de inmovilización se abre la posibilidad de biosensores descartables, sensibles y de bajocosto. La cronoimpedancimetría fue la técnica utilizada para la determinaciónde la glucosa. Respecto de los TFs, se investigó el comportamiento del ZnO depositado como un film delgado nanoestructurado (TF) sobre un sustrato aislante eléctricamente (AlO3 o Zafiro). Se estudiaron las propiedades de transportede este nanomaterial mediante la espectroscopia de impedancia. Estas mediciones se realizaron analizando diferentes situaciones, como ser agregados desoluciones buffer y de glucosa en distintas concentraciones, con y sin enzimainmovilizada.8Otra nanoestructura estudiada fueron las NPs de Titanio, con las cuales sedesarrolló un biosensor para la detección del HLB. El mismo consiste en unbiosensor de inhibición, en el cual, las NPs de Ti permiten la inmovilizaciónde una cantidad adecuada de enzima en el biosensor para hacerlo lo suficientemente sensible. Estudiando NPs de Prussian Blue, se desarrolló también unsensor electroquímico para el mismo fin. Este sensor permite la medición demuy bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno (H2O2).El HuangLongBing (HLB) es la enfermedad más destructiva de los cítricosen el mundo debido a la severidad de los síntomas. Hasta el momento no existeun tratamiento curativo, solo se adoptan medidas para evitar su expansión. Debido a que la enfermedad presenta un largo periodo de latencia presintomático(mayor a 6 meses) durante el cual se sigue produciendo la transmisión, la principal medida de lucha es un riguroso monitoreo de plantas y vectores, mediantemétodos de diagnóstico rápidos y sensibles a fin de responder inmediatamenteante la aparición del patógeno. Los métodos actuales para detectar al patógenoincluyen microscopía, serología y técnicas de biología molecular basadas en hibridización ADN-ADN y en reacciones de amplificación de secuencias de ADNespecíficas del patógeno, como PCR y LAMP. Por lo expuesto, y empleando lasnanoestructuras estudiadas, se buscó desarrollar un sistema de diagnóstico enbase a nanotecnología para detectar al mismo tiempo diferentes ?analitos marcadores? de la presencia de la bacteria en la planta, y en especial en sus primerosestadios, de tal forma que permita hacer una detección rápida, sensible, especifica, de bajo costo y que pueda ser realizada en campo, sin necesidad de llevarmuestras al laboratorio. Se evaluaron diferentes métodos de inmovilización dela enzima peroxidasa de rábano en diferentes sustratos. Se estudió como soporte polimérico al Tereftalato de polietileno (PET) y las formas de modificarlo paralograr la mejor funcionalización. Los agentes evaluados para la inmovilizaciónde la enzima fueron el Polyethylenimine (PEI), Chitosan, Glutaraldehido y dostipos de nanopartículas (de ZnO y óxido de titanio). El biosensor evalúa la actividad de la enzima peroxidasa cuando se colocan extractos de hojas de plantasde citrus en los cuales se simularon condiciones de enfermedad.El tercer sensor que se desarrolló, fue un sensor de H2O2, el cual es un importante analito presente en reacciones enzimáticas, industria y medicina. Seinvestigó el empleo de un compuesto reactivo al H2O2, el Prussian Blue (PB),el cual fue nanoestructurado de dos maneras, en forma de film (PBTF) y de nanopartículas (PBNPs). En el caso del PBTF, se electrodepositó usando dos técnicas diferentes, electroestática y electrodinámicamente sobre microelectrodos deplatino (ECC MDEA 5037-Pt; ABTECH Scientific, Inc.) y se estudiaron sus respuestas electroquímicas. El método potencioestático mostró una sensibilidad200 veces mayor que el potenciodinámico. Las PBNPs y su capacidad electrocatalítica sobre el H2O2, fue evaluada haciendo uso de dos electrodos, uno deoro y otro con óxido de iridio electrodepositado (EIROF) sobre oro. Con la técnica de síntesis de PBNPs y funcionalización de los electrodos se logró medirH2O2 de manera estable en medios básicos a 0V, presentando la mejor respuestael electrodo de nanoestructuras combinadas EIROF-PBNPs. Estos mismos electrodos se empelaron para evaluar la respuesta electroquímica frente a extractosetanólicos de hojas de plantas de citrus.Por último, para el estudio de los diferentes métodos de funcionalización delos sustratos para la inmovilización adecuada de los bioreceptores y nanoestructuras, y considerando que el ?drop-casting? es una técnica sencilla peroque no permite un control preciso sobre el diseño de los biosensores, se estudió por útlimo, la inmovilización de nanopartículas de ZnO sobre monocapasautoensambladas (SAMs). La inmovilización estable y homogénea de las nanoestructuras sobre sustratos sólidos es un factor clave para el desarrollo de lossensores. La estabilidad de las nanoestructuras se evaluó usando X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS), Contact Angle (CA) y Microscopía electrónica deBarrido (SEM). Por último, la funcionalización con anticuerpos y la deteccióndel antígeno específico se realizó mediante diferentes técnicas electroquímicas.Fil: Trujillo, Ricardo Matias. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Ciencias Exactas y Tecnología; Argentin

Integración de diferentes fenómenos fotónicos en tecnología de disco compacto para el desarrollo de biosensores label-free

Tesis por compendio[ES] En esta tesis se ha abordado el desarrollo de biosensores ópticos label-free, basados en tecnología de disco compacto, permitiendo así abaratar y simplificar su fabricación. El trabajo llevado a cabo ha consistido en estudiar diferentes propiedades físico-químicas desarrolladas por diversos materiales. Ello ha permitido obtener sistemas compactos y accesibles, capaces de sensar con buenas prestaciones analíticas en diferentes escenarios. En el capítulo 1 se presenta un estudio de inhibición enzimática sobre discos Blu-ray como plataforma de ensayo para el cribado de fármacos. Para ello, se inmoviliza orientadamente una glicoenzima, de la familia de las peroxidasas sobre la superficie del disco, cuya actividad se relaciona con los compuestos a cribar. Después de ensayar cada compuesto, se determina el grado de inhibición enzimática mediante la adición de un sustrato. La cantidad de producto obtenido, inversamente proporcional al potencial inhibitorio del compuesto en estudio, es cuantificado con un lector de discos que registra las variaciones en la intensidad del haz laser reflejado debidas al producto enzimático. Ello permite realizar más de 1700 ensayos simultáneos en un único disco Blu-ray lo que muestra su potencial en análisis masivo de alto rendimiento. Además, se plantea una estrategia basada en hipersuperficies para el análisis de la elevada cantidad de datos que se generan en las etapas del proceso de descubrimiento de fármacos. En el capítulo 2 se aborda el estudio de una metodología para reducir el ruido generado en la lectura de resultados obtenidos con biosensores ópticos, mejorando así su sensibilidad. Para ello, se plantea la estructuración del ensayo en forma de franjas en lugar del tradicional microarray, generando una señal periódica sinusoidal al ser escaneadas. Al analizar dicha señal en dominio de frecuencias, ésta se concentra en un pico a la frecuencia del ensayo, mientras que la mayor parte del ruido aparece a frecuencias mucho más altas. Inicialmente se quería reducir al máximo el ruido, para diferenciar las interacciones moleculares en formato label free. Sin embargo, los ensayos realizados con discos DVD no generaron suficiente señal, teniendo que recurrir en esta ocasión al marcaje para la cuantificación de inmunoglobulinas G y de caseína. Pese a ello, la metodología desarrollada también se puede aplicar en biosensores tipo label-free, reduciendo el ruido y mejorando su sensibilidad. El capítulo 3 se centra en el desarrollo de sustratos interferométricos multicapa que varían la intensidad de la luz reflejada al realizar un ensayo analítico en su superficie. Los sustratos fueron fabricados utilizando los materiales que componen los DVD-RW, depositados en capas de espesor controlado con el fin de obtener la máxima respuesta. A su vez, se diseñaron de tal forma que uno de ellos disminuya la intensidad del haz reflejado como respuesta a las interacciones moleculares, mientras que el otro la aumenta. El trabajo incluye la utilización de principios y materiales de la tecnología de disco compacto para el desarrollo del sistema de detección. Para ello, se emplea el cabezal de un lector de DVD, ya que dispone de un láser y de todos los elementos ópticos necesarios para el escaneado vertical. Con este sistema se cuantifican con éxito y sin marcaje inmunoglobulinas G y sulfasalazina, una macromolécula y un fármaco de masa molecular reducida. El capítulo 4 consiste en la fabricación de un cristal fotónico utilizando la estructura de los discos compactos cubiertos con una película de óxido de titanio. Se han estudiado las propiedades físico-químicas de estos sustratos y se han caracterizado sus propiedades fotónicas. Todo ello está en concordancia con los resultados obtenido mediante simulaciones. Para interrogar los cristales fotónicos fueron necesarios una fuente de luz blanca y un espectrofotómetro, además de los elementos ópticos necesarios[CA] En aquesta tesi s'ha abordat el desenvolupament de biosensors òptics label-free, basats en tecnologia de disc compacte, permetent així abaratir i simplificar la seua fabricació. El treball dut a terme ha consistit en estudiar diferents propietats fisicoquímiques desenvolupades per diversos materials. Això ha permès obtenir sistemes compactes i accessibles, capaços de sensar, amb bones prestacions analítiques, en diferents escenaris. En el capítol 1 es presenta un estudi d'inhibició enzimàtica sobre discos Blu-ray com a plataforma d'assaig per al cribratge de fàrmacs. Per a això, s'immobilitza de manera orientada una glicoenzima de la família de les peroxidases sobre la superfície del disc, i la seua activitat es relaciona amb els compostos a garbellar. Després d'assajar cada compost, es determina el grau d'inhibició enzimàtica mitjançant l'addició d'un substrat. La quantitat de producte obtingut, inversament proporcional al potencial inhibitori del compost en estudi, és quantificat amb un lector de discos que registra les variacions en la intensitat del làser reflectit degudes al producte enzimàtic. Això permet realitzar més de 1700 assajos simultanis en un únic disc Blu-ray el que mostra el seu potencial en anàlisi massiva d'alt rendiment. A més, es planteja una estratègia basada en hipersuperficies per a l'anàlisi de l'elevada quantitat de dades que es generen en les etapes del procés de descobriment de fàrmacs. En el capítol 2 s'aborda l'estudi d'una metodologia per reduir el soroll generat en la lectura de resultats obtinguts amb biosensors òptics, millorant així la seua sensibilitat. Per a això, es planteja l'estructuració de l'assaig en forma de franges en lloc del tradicional microarray, generant un senyal periòdic sinusoïdal en ser escanejades. En analitzar aquest senyal en domini de freqüències, aquesta es concentra en un pic a la freqüència de l'assaig, mentre que la major part del soroll apareix a freqüències molt més altes. Inicialment es volia reduir al màxim el soroll, per diferenciar les interaccions moleculars en format label-free. No obstant això, els assajos realitzats amb discos DVD no van generar prou senyal, havent de recórrer en aquesta ocasió al marcatge per a la quantificació d'immunoglobulines G i de caseïna. Malgrat això, la metodologia desenvolupada també es pot aplicar en biosensors tipus label-free, reduint el soroll i millorant la seua sensibilitat. El capítol 3 es centra en el desenvolupament de substrats interferometrics multicapa que varien la intensitat de la llum reflectida en realitzar un assaig analític en la seua superfície. Els substrats van ser fabricats utilitzant els materials que componen els DVD-RW, dipositats en capes de gruix controlat per tal d'obtenir la màxima resposta. Al seu torn, es van dissenyar de tal manera que un d'ells disminueixi la intensitat del feix reflectit com a resposta a les interaccions moleculars, mentre que l'altre l'augmenta. El treball inclou la utilització de principis i materials de la tecnologia de disc compacte per al desenvolupament del sistema de detecció. Per a això, es va utilitzar el capçal d'un lector de DVD, ja que disposa d'un làser i de tots els elements òptics necessaris per a l'escanejat vertical. Amb aquest sistema es quantifiquen amb èxit i sense marcatge immunoglobulines G i sulfasalazina, un macromolècula i un fàrmac de massa molecular reduïda. El capítol 4 consisteix en la fabricació d'un cristall fotònic utilitzant l'estructura dels discos compactes coberts amb una pel·lícula d'òxid de titani. S'han estudiat les propietats fisicoquímiques d'aquests substrats i s'han caracteritzat les propietats fotòniques. Tot això està en concordança amb els resultats obtingut mitjançant simulacions. Per interrogar els cristalls fotònics van ser necessaris una font de llum blanca i un espectrofotòmetre, a més dels elements òptics necessaris per guiar la llum.[EN] In this thesis the development of label-free optical biosensors, based on compact disc technology, has been approached, thus making their manufacture cheaper and simpler. The work carried out has consisted of studying different physical-chemical properties manifested with several materials. This has allowed to obtain compact and accessible systems, capable of sensing with a great analytical performance in different scenarios. Chapter 1 presents an enzymatic inhibition study on Blu-ray discs as a test platform for drug screening. For this purpose, a glycoenzyme of the peroxidase family is immobilized on the surface of the disc whose activity is related to the compounds to be screened. After testing each compound, the degree of enzymatic inhibition is determined by adding the enzymatic substrate. The amount of product obtained is inversely proportional to the inhibitory potential of the compound, and is quantified with a disk reader that records the variations in the intensity of the reflected laser beam due to the enzymatic product. In addition, more than 1700 tests are performed on a single Blu-ray disc as proof of concept for application in high performance analysis and a hypersurface based strategy is proposed for the analysis of the large amount of data generated in the stages of the drug discovery process. Chapter 2 deals with the study of a methodology to reduce noise generated in the reading of results obtained with optical biosensors, hence improving their sensitivity. For this purpose, the structure of the test is proposed in the form of stripes instead of the traditional microarray, generating a sinusoidal periodic signal when they are scanned. When analysing this signal in frequency domain, it is concentrated in a peak at the frequency of the test, while most of the noise appears at much higher frequencies. Initially, the aim was to reduce noise as much as possible in order to differentiate molecular interactions in a label-free format. However, the tests carried out on a DVD did not generate enough signal, having to resort to labelling on this occasion for the quantification of immunoglobulins G and casein. Nevertheless, the methodology developed can be applied to label-free biosensors, reducing noise and improving sensitivity. Chapter 3 focuses on the development of multilayer interferometric substrates that vary the intensity of reflected light when performing an analytical test on their surface. The substrates were manufactured using the materials that make up the DVD-RW, deposited in layers of controlled thickness in order to obtain maximum response. At the same time, they were designed in such a way that one of them decreased the intensity of the reflected beam as a response to molecular interactions, while the other increased it. The work includes the use of principles and materials from compact disc technology for the development of the detection system. For this, the head of a DVD reader is used, as it has a laser and all the optical elements necessary for vertical scanning. With this system, immunoglobulins G and sulfasalazine, a macromolecule and a drug with reduced molecular mass are successfully quantified without labelling. Chapter 4 consists of the fabrication of a photonic crystal using the structure of the compact discs covered with a titanium oxide layer. The physical-chemical properties of these substrates have been studied and their photonic properties have been characterized. All this is in accordance with the results obtained through simulations. To interrogate the photonic crystals, a white light source and a spectrophotometer were needed, as well as the optical elements necessary to guide the light.Sancho Fornés, G. (2019). Integración de diferentes fenómenos fotónicos en tecnología de disco compacto para el desarrollo de biosensores label-free [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/124819TESISCompendi

Desarrollo de métodos inmunoquímicos para la determinación de sustancias tóxicas en alimentos y aguas

[ES] El objetivo de la presente tesis doctoral es el estudio, desarrollo y validación de diferentes métodos inmunoquímicos que permitan determinar contaminantes químicos en alimentos de origen vegetal y en agua, de manera que contribuyan a mejorar su calidad y por ende la seguridad del consumidor. Spirotetramat es un plaguicida de nueva generación altamente eficiente, comercializado mundialmente para su uso como insecticida en multitud de cultivos agrícolas. Tiene propiedades sistémicas, ya que después de la absorción se transloca tanto a través del xilema como del floema, gracias a que es transformado por la planta en spirotetramat-enol, mucho más polar. En consecuencia, la definición de residuo de este insecticida en alimentos de origen vegetal para fines analíticos incluye también dicho metabolito. Por otro lado, anatoxina-a es un alcaloide secundario con neurotoxicidad aguda que se pueden encontrar en agua dulce. Esta toxina es producida por siete géneros diferentes de cianobacterias, y se ha detectado en lagos y otras fuentes de agua de todos los continentes. El análisis de sustancias como spirotetramat y anatoxina-a se lleva a cabo actualmente mediante métodos cromatográficos como HPLC-MS. Estas técnicas presentan una elevada sensibilidad y fiabilidad; sin embargo, requieren personal altamente cualificado y un equipamiento caro y no portable. Una opción complementaria son los métodos inmunoquímicos, como el ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) o el inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, Lateral Flow ImmunoAssay), ya que son métodos de análisis rápidos y económicos, y además son muy versátiles permitiendo adaptarlos a necesidades analíticas particulares, como los ensayos de cribado de numerosas muestras o los ensayos portátiles con lectura visual de los resultados. A partir de una colección de bioconjugados y de anticuerpos de spirotetramat y de anatoxina-a se caracterizó la afinidad y especificidad de los inmunorreactivos con el fin de seleccionar parejas conjugado/anticuerpo aptas para el desarrollo de inmunoensayos tipo ELISA y LFIA competitivos. Se optimizaron las condiciones de ensayo, y se llevó a cabo un estudio de la influencia de diferentes factores fisicoquímicos sobre los parámetros analíticos de los ensayos seleccionados. Posteriormente se evaluó la influencia de la matriz alimentaria, particularmente uva, zumo de uva y vino, así como de aguas de diferente procedencia, sobre la señal y la sensibilidad de los inmunoensayos. La diferente afinidad de los anticuerpos hacia spirotetramat y spirotetramat-enol nos llevó a optimizar el tratamiento de muestra, incluyendo una etapa de hidrólisis para transformar spirotetramat en spirotetramat-enol de manera controlada, rápida y cuantitativa. De este modo se hizo posible aportar resultados en forma de suma de la concentración de ambos compuestos en la muestra, tal y como exige la legislación vigente. Además, para la extracción de residuos de este insecticida a partir de muestras de uva se puso a punto un procedimiento empleando la tecnología QuEChERS, y para la reducción de interferencias de vinos y zumos se utilizó polivinilpolipirrolidona. En el caso de las aguas, se aplicó una simple filtración para eliminar partículas en suspensión. Los inmunoensayos enzimáticos en microplaca optimizados para determinar de manera competitiva residuos de spirotetramat presentaron valores de IC50 para spirotetramat-enol en torno a 0.1 ng/mL, y límites de detección alrededor de 0.02 ng/mL. El estudio de la precisión y exactitud del método empleando muestras de alimentos dopados reflejó límites de cuantificación de 2.5 ng/mL para uva, zumos de uva y vinos, tanto blancos como tintos, muy por debajo de los límites máximos de residuos autorizados en la Unión Europea para este insecticida en dichos alimentos.[EN] The aim of this doctoral thesis is the study, development and validation of different immunochemical methods for determining chemical contaminants in produce and water, in a way that they may contribute to improving food quality and therefore to assure consumer safety. Spirotetramat is a highly efficient new-generation pesticide, marketed worldwide for use as insecticide in many agricultural crops. It has systemic properties, since short after absorption it translocates through both the xylem and the phloem, thanks to the fact that it is transformed by the plant into the much more polar spirotetramat-enol. Consequently, the residue definition for this insecticide in foods of plant origin with analytical purposes also includes said metabolite. On the other hand, anatoxin-a is a secondary alkaloid with acute neurotoxicity that can be found in fresh water. This toxin is produced by seven different genera of cyanobacteria, and has been detected in lakes and other water resources on all continents. The analysis of substances like spirotetramat and anatoxin-a is currently carried out by chromatographic methods like HPLC-MS. These techniques are highly sensitive and reliable; however, they require highly qualified personnel and expensive, non-portable equipment. Nowadays, the immunochemical methods, such as the ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) or the LFIA (Lateral Flow ImmunoAssay), constitute excellent complementary analytical options to instrumental strategies, since they are fast and inexpensive analytical methods, and are also very versatile so they can be adapted to particular analytical needs, such as screening assays for large numbers of samples or portable tests with visual reading of the results. The antibody affinity and specificity from a collection of spirotetramat and anatoxin-a immunoreagents was characterized in order to select conjugate/antibody pairs suitable for the development of competitive ELISA and LFIA tests. The assay conditions were optimized, and a study of the influence of different physicochemical factors over the analytical parameters of the selected immunoassays was carried out. Subsequently, the influence of the food matrix, particularly grape, grape juice and wine, as well as water from different sources, over the assay signal and sensitivity was evaluated. The different affinity of the available antibodies towards spirotetramat and spirotetramat-enol led us to optimize the sample treatment procedure, so a hydrolysis step to transform spirotetramat into spirotetramat-enol in a controlled, rapid and quantitative way, was included. Thus, it was possible to provide results in the form of the sum of the concentration of both compounds in the sample, as required by current legislation. In addition, a procedure using QuEChERS technology was developed to extract residues of this insecticide from grape samples, and polyvinylpolypyrrolidone was used to reduce interferences from wines and juices. In the case of waters, a simple filtration was applied to remove suspended particles. Microplate enzyme immunoassays that were optimized to competitively determine spirotetramat residues showed IC50 values for spirotetramat-enol around 0.1 ng/mL, and limits of detection around 0.02 ng/mL. Precision and accuracy studies with these immunoassays using fortified food samples reflected limits of quantification of 2.5 ng/mL for grapes, grape juices and wines, both white and red, well below the maximum residue limits authorized by the European Union for this insecticide in such foodstuffs. Finally, a comparative study with HPLC-MS/MS validated the studied immunoassay for analyzing spirotetramat residues in grape samples within a wide range of concentrations.[CA] L’objectiu de la present tesi doctoral és l’estudi, desenvolupament i validació de diferents mètodes immunoquímics que permeten determinar contaminants químics en aliments d’origen vegetal i en aigua, de manera que contribuïsquen a millorar la seua qualitat i per tant la seguretat dels consumidors. Spirotetramat és un plaguicida de nova generació altament eficient, comercialitzat mundialment per a l’ús com insecticida en multitud de cultius agrícoles. Té propietats sistèmiques, ja que en ser absorbit es transloca tant a través del xilema com del floema, gràcies a que és transformat per la planta en spirotetramat-enol, molt més polar. Conseqüentment, la definició de residu d’aquest insecticida en aliments d’origen vegetal amb finalitats analítiques inclou també l’esmentat metabòlit. D’una altra banda, anatoxina-a és un alcaloide secundari amb neurotoxicitat aguda que es pot trobar en aigua dolça. Aquesta toxina és produïda per set gèneres de cianobacteris diferents, i s’ha detectat en llacs i altres fonts d’aigua de tots els continents. L’anàlisi de substàncies com spirotetramat i anatoxina-a es duu a terme actualment mitjançant mètodes cromatogràfics, com HPLC-MS. Aquestes tècniques presenten una elevada sensibilitat i fiabilitat; tanmateix, requereixen personal altament qualificat i un equipament car i no portable. Una opció complementària són els mètodes immunoquímics, com l’ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) o l’immunoassaig de flux lateral (LFIA, Lateral Flow Immunoassay), ja que són mètodes d’anàlisi ràpids i econòmics, i a més són molt versàtils, la qual cosa permet adaptar-los a necessitats analítiques particulars, com són els assaigs per destriar nombroses mostres o els assaigs portàtils amb lectura visual dels resultats. A partir d’una col·lecció de bioconjugats i d’anticossos de spirotetramat i d’anatoxina-a es va caracteritzar l’afinitat i especificitat dels immunorreactius amb la finalitat de seleccionar parelles conjugat/anticòs aptes per desenvolupar immunoassaigs tipus ELISA i LFIA competitius. S’optimitzaren les condicions d’assaig, i es va dur a terme un estudi de la influència de diferents factors fisicoquímics sobre els paràmetres analítics dels assaigs seleccionats. Posteriorment, es va avaluar la influència de la matriu alimentària, particularment raïm, suc de raïm i vi, així com d’aigües de diferent procedència, sobre el senyal i la sensibilitat dels assaigs. La diferent afinitat dels anticossos cap a spirotetramat i spirotetramat-enol ens va dur a optimitzar el tractament de mostra mitjançant la inclusió d’una etapa d’hidròlisi per transformar spirotetramat en spirotetramat-enol de manera ràpida, controlada i quantitativa. D’aquesta manera es va fer possible aportar resultats en forma de suma de la concentració d’ambdós composts en la mostra, tal i com exigeix la legislació vigent. A més a més, per extraure residus d’aquest insecticida a partir de mostres de raïm es va posar a punt un procediment emprant la tecnologia QuEChERS, i per reduir interferències de vins i sucs es va utilitzar polivinilpolipirrolidona. En el cas de les aigües, es va aplicar una simple filtració per eliminar partícules en suspensió. Els immunoassaigs enzimàtics en microplaca optimitzats per determinar de manera competitiva residus de spirotetramat presentaren valors d’IC50 per spirotetramat-enol al voltant de 0.1 ng/mL, i límits de detecció propers a 0.02 ng/mL. L’estudi de la precisió i exactitud del mètode emprant mostres d’aliments dopats va reflectir límits de quantificació de 2.5 ng/mL per raïm, sucs de raïm i vins, tant blancs com negres, molt per sota dels límits màxims de residus autoritzats per la Unió Europea per a aquest insecticida en els esmentats aliments. Finalment, un estudi comparatiu amb HPLC-MS/MS va validar l’immunoassaig estudiat per analitzar residus de spirotetramat en mostres de raïm en un ampli rang de concentracions. En el cas d’anatoxina-a, es van optimitzar dos immunoassaigs tipus ELISA competitiu, els valors d’IC50 dels quals van estar entre 0.5 i 1.0 ng/mL, amb límits de detecció per davall de 0.1 ng/mL. L’anàlisi de diferents tipus d’aigües fortificades amb anatoxina-a ens va revelar que els immunoassaigs desenvolupats permeten quantificar aquesta cianotoxina entre 0.5 i 500 ng/mL. Addicionalment es van optimitzar i caracteritzar assaigs immunocromatogràfics, tipus tires reactives, tant per spirotetramat com per anatoxina-a, vàlids com a tècniques portables i ràpides per determinar semi-quantitativament aquestes substàncies tòxiques en vi i aigües, respectivament. Seguint la normativa europea per a mètodes ràpids front a petites molècules orgàniques, es va determinar el senyal indicatiu del llindar per distingir les mostres positives, que superen la concentració de destriament establerta, de les negatives. En el cas de spirotetramat, el mètode desenvolupat permet el triatge, tant instrumental com visual, amb un interval de confiança del 99%, de mostres de vi amb una concentració de residu de 1000 ng/mL, equivalent al límit màxim de residus, expressada como la suma de spirotetramat més spirotetramat-enol. Per anatoxina-a, les tires immunocromatográfiques desenvolupades van poder detectar mostres d’aigua amb 2 ng/mL de l’esmentada cianotoxina amb una fiabilitat del 99%, i mostres amb 1 ng/mL amb una probabilitat del 40%, mentre que el límit de detecció visual va ser de 3 ng/mL.A la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación (SENESCYT), del gobierno de la República de Ecuador que al adjudicarme la beca bajo el “PROGRAMA DE BECAS PARA DOCTORADO (PHD) PARA DOCENTES DE UNIVERSIDADES Y DE ESCUELAS POLITÉCNICAS 2015”, permitió formarme como persona y profesional en mis estudios de doctorado.Cevallos Cedeño, RE. (2020). Desarrollo de métodos inmunoquímicos para la determinación de sustancias tóxicas en alimentos y aguas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/149570TESI

Evaluación del uso de aptámeros para el desarrollo de un biosensor basado en carbon dots para la detección de pesticidas organofosforados en agua

69 páginasRESUMEN: Los pesticidas organofosforados son ampliamente utilizados en la industria agrícola para la mejora de la producción de los cultivos, sin embargo, se estima que apenas el 1% de la cantidad de pesticida aplicado en el área de interés es realmente aprovechado por las plantas y el resto se convierte en un contaminante ambiental que puede llegar fácilmente a los cuerpos de agua por escorrentía. Aunque actualmente se utilizas técnicas confiables basadas en cromatografía para la detección de dichos contaminantes, estas suelen ser tediosas dado que necesita de personal altamente calificado y equipos robustos que inviabilizan la caracterización de muestras en campo. Por esto, a lo largo del tiempo se ha incrementado el interés por el desarrollo de tecnologías que permitan la detección de dichos contaminantes de manera precisa, portable y en tiempo real para evitar los efectos adversos que estas sustancias puedan llegar a producir en los ecosistemas y hacia la salud humana. Los biosensores poseen el potencial para superar estas limitaciones de las tecnologías tradicionales y existe gran cantidad de producción literaria enfocada en la capacidad de detección de estos dispositivos para diversas moléculas analito, incluidos los pesticidas. Del mismo modo, se ha aumentado el interés por el uso de aptámeros como biorreceptor para el desarrollo de biosensores, los cuales son oligonucleótidos monocatenarios de secuencias cortas generados mediante un proceso in vitro, ya que posee mayor selectividad en comparación con el uso de anticuerpos o enzimas. En este trabajo se evaluó el uso de aptámeros para el desarrollo de un biosensor basado en carbon dots para la detección de pesticidas organofosforados, para lo cual se aplicó una metodología divida en tres fases, en la primera se realizó una revisión bibliográfica para identificar las condiciones que influyen en el desempeño de los aptámeros en los procesos de detección, en la segunda se realizaron protocolos experimentales para determinar la estrategia de detección más adecuada del sistema aptámero-carbon dots, por último, se evaluó la respuesta del sistema a diferentes concentraciones de los pesticidas organofosforados clorpirifos y profenofos. Con lo anterior, se logró con éxito la conjugación entre los aptámeros y los carbon dots mediante la caracterización por espectroscopia UV VIS, espectroscopia de fluorescencia y microscopia electrónica de transmisión (TEM). También, se encontró que las mejores condiciones de detección se presentaban con el uso de óxido de grafeno como agente modulador de fluorescencia y se realizaron pruebas para determinar la concentración mediante la cual se lograba una inactivación de la fluorescencia de los carbon dots más eficiente. Por último, se evaluó la respuesta de recuperación de señal de fluorescencia del sistema aptámero-carbon dots al exponerse a diferentes concentraciones de los analitos, en donde se identificó una tendencia de recuperación de fluorescencia proporcional al aumento de las concentraciones de los pesticidas.ABSTRACT: Organophosphorus pesticides are widely used in the agricultural and agroforestry industry to improve crop production; however, it is estimated that only 1% of the amount of pesticide applied about the area of interest is used by plants and the rest becomes an environmental pollutant that can easily reach water bodies through runoff. Although reliable techniques based on chromatography are currently used for the detection of these pollutants, they are usually tedious because they require highly qualified personnel and robust equipment that make the characterization of samples in the field unfeasible. For this reason, over time there has been an increasing interest in the development of technologies that allow the detection of these contaminants in an accurate, portable and real time way to avoid the adverse effects that these substances can produce in ecosystems and human health. Biosensors have the potential to overcome these limitations of traditional technologies and there is a large body of literature focused on the detection capabilities of these devices for various analyte molecules, including pesticides. Similarly, there has been increasing interest in the use of aptamers as a bioreceptor for the development of biosensors, which are single stranded oligonucleotides of short sequences generated by an in vitro process, as they possess greater selectivity compared to the use of antibodies or enzymes. In this work, the use of aptamers was evaluated for the development of a biosensor based on carbon dots for the detection of organophosphorus pesticides, for which a methodology divided into three phases was applied. In the first phase, a literature review was carried out to identify the conditions that influence the performance of aptamers in the detection processes, In the second, experimental protocols were carried out to determine the most appropriate detection strategy for the aptamer-carbon dots system. Finally, the response of the system to different concentrations of the organophosphorus pesticides chlorpyrifos and profenofos was evaluated. With the above, the conjugation between aptamers and carbon dots was successfully achieved through characterization by UV VIS spectroscopy, fluorescence spectroscopy and transmission electron microscopy (TEM). Also, it was found that the best detection conditions were presented with the use of graphene oxide as a fluorescence modulating agent and tests were performed to determine the concentration by which the most efficient inactivation of carbon dots fluorescence was achieved. Finally, the fluorescence signal recovery response of the aptamer-carbon dots system when exposed to different concentrations of the analytes was evaluated, where a fluorescence recovery trend proportional to the increase of the pesticide concentrations was identified.PregradoIngeniero(a) Ambienta